[qPCR tip] HRM (high resolution melting) -1

High resolution melting 은 real time PCR 실험 기법 중 비교적 최신 기법이라 할 수 있겠다.

PCR product 가 만들어지면 그 PCR product 는 DNA 서열에 따라 고유의 Tm 값을 갖는다.
(DNA 는 double strand 구조에서 A와T 는 이중결합을 C와 G 는 삼중결합을 하므로...^^)

Double strand 에 끼어 들어가는 intercalating dye 는  PCR product 에 끼어들어가게 되고 형광 파장을 emmision 하게 된다. 이때 온도를 낮은 온도에서 높은 온도로 서서히 올리면, PCR product 는 고유의 Tm 값 (특정온도) 에서 denaturation, 즉 double strand 에서 single strand 로 바뀌게 되고 형광 값이 급격히 떨어지게 된다. 이때의 온도를 melting temperature 라 하며 이 melting temperature 의  차이를 detection 하여 PCR product 에서 서열 하나의 차이까지 구분해 내는 technology 가 high resolution melting 인 것이다.

아래 그림처럼 SNP 의 Homo type, hetero type 을 classification 해준다.
예를들어 A 또는 C type 의 SNP 이라면 AA type, CC type, AC type 세 가지 형태일 것이고 melting point 는 AA < CC 일 것이다. 그리고 AG hetero type 일경우 AA , CC 가 반반씩 그리고 AC one base mismatching 과 CT onebase mismatching 을 가질 것이다.  

그러므로 가장 빨리 그래프가 떨어지는 것은 AA type 일 것이고, CC type 이 Tm 이 높으므로 가장 늦게, hetero type 의 경우 아래 그림처럼 두 기울기가 섞여 교차하는 것과 같은 양상일 것이다.

위 그래프는 starting 형광 값과 ending point 의 형광값을 normalization 한 그래프이다. wild type 또는 mutant type 그래프로 normalization 하여 보면 그 차이를 더욱 명확히 볼 수 있다. (아래 그림)

high resolution melting 은 이렇듯 PCR product 내 DNA 의 서열차이를 분석하는 application 에 사용되므로 Single nucleotide polymorhpism (SNP genotyping), mutation discovery, CpG methylation 등 Genecis association study 에 사용될 수 있다.

HRM 기법의 장점은 무엇일까? 일단 probe 없이 PCR primer 만 사용하므로 실험 단가 적인 부분이 많이 절감 될 수 있을 것이다. 물론 디자인도 probe 에 비해 간단하므로 setting 도 용이할 것이다. 따라서 많은 샘플에 대한 screening 실험에도 적합한 기법이라 생각된다. 

-Augustine