[qPCR tip] HRM (high resolution melting) - 2

HRM 기법을 수행하기 위해서는 다음과 같은 요건이 충족되어야 한다.

1. LC green, Eva green 과 같이 DNA double strand 에 촘촘하게 끼어 들어가는 satuating dye 를 사용해야 한다.
-SYBR green 의 경우 듬성듬성 끼어 들어가므로 서열 하나의 변화를 형광 파장으로 감지하기 어려울 것이다.

2. HRM 분석을 위한 소프트웨어가 필요하다.
- 아래 설명과 같은 기능이 필요하다.

3. 미세한 온도차이를 구분해야 하므로 well (sample) 간 온도 variation 이 존재하지 않고, 정교하게 온도를 control 할 수 있는 realtime PCR machine 이 필요하다.
-Class IV SNP 의 경우 ( A가 T 로 변화하는) 0.2 도 이하의 Tm 변화를 갖는다. 따라서 well 간 온도 variaton 이 0.2 도 이상일 경우 이를 정확히 구분하기 어려울 것이다.


HRM 은 다음과 같은 step 으로 분석된다.

step 1 : 샘플의 증폭과정
step 2 : 샘플의 target 부위가 specific 하게 증폭되었는지 일반적인 melting curve 실험으로 확인함. 이는 optional step 으로 조건이 잡힌 assay 라면 수행하지 않아도 된다.
step 3 : high resolution melting 수행, 수행후 starting poing 와 ending point 를 설정하여 normaization 을 하고 genotype 과 control sample 을 지정함. 
step 4 : nomalizaton할 type 을 지정함. 지정된 type으로 signal 을 substraction 하여 normalization함.
이 difference plot graph 로 각 샘플의 genotype 을 시각적으로 더욱 확실히 구분 할 수 있다.


HRM 기법을 이용하여 SNP 를 분석할 경우 control sample 을 함께 running 해야한다. AA homo type, BB homo type 가능하다면 AB hetero type 까지 unknown sample 과 함께 running 한다.

CpG Metylation 분석의 경우 unmethyl control DNA, methyl control DNA 와 함께 두 control 을 일정 비율로 섞어 만든 25%, 50% , 75% 의 control sample 을 함께 running 한다. 메틸레이션 실험 예는 다음과 같다.

methylation 은 bisulfite 처리 이후에 C 와 U 의 서열 차이를 보는 것이며, CpG sie 의 서열이 C 인 경우 methyl, U 일 경우 unmethyl 인 것이다.  따라서 methylation 이 된 서열 (서열이 C) 인 경우 PCR product 의 Tm 이 unmethyl 의 PCR product 보다 높아 더 높은 온도에서 형광 값이 떨어질 것이다. 그리고 이는 메틸화 빈도에 따라 달리 나타날 것이다. 

여기서 도출된 methylation freqency (%) 는 증폭된 PCR product 내에 존재하는 여러개의 CpG site 의 메틸화 빈도의 평균값이 될 것이며 각각의 CpG site 의 individual 한 CpG level 을 알 수는 없다.

마지막으로 High resolution melting 실험시 참고할만한 내용을 정리해 보았다.
< HRM tip >

1. PCR product 길이가  70 ~ 150 bp 되도록 primer를 디자인 함.
2. 처음 assay 를 셋팅할 경우 65 도에서 95 도로 0.1 도/ 2 sec. 로 온도를 올려 수행한다. 이를 통해 product 들의 Tm 값에 대한 정보를 확보한 후엔 Tm 값을 기준으로 -5 도 에서 +5 도로 설정해준다. 
3. 샘플들의 농도를 가급적 동일하게 해야한다. 샘플간 Ct value 의 차이가 3을 넘어서는 안된다. (약 10배 차이?)
4. one specific product 인지 check 하라.
5 PCR product 는 plateau phase 까지 증폭이 되어야 하므로 cycle 수를 40 cycle 이상으로 설정한다.
6. 모든 product 의 Ct value 는 30 이하여야 한다.

-Augustine